此后，作者进一步发现肿瘤中免疫细胞的增殖和凋亡等能力在不同时间节点没有展示出不同，但注射阻断剂（LFA-1）能有效抑制ZT13组的肿瘤内免疫细胞浸润，这表明时间节律很可能是影响了免疫细胞对肿瘤的浸润功能。

随后，作者通过注射免疫细胞至处于不同时间节律的荷瘤小鼠模型，进一步确认其浸润是受到时间节律的影响。作者分别给处于ZT1和ZT13的荷瘤小鼠注射了OVA-specific CD8+T细胞（OT-l cell），2小时后观察发现ZT13注射的小鼠肿瘤内CD8+T细胞数量更多，且后续数日的肿瘤控制效果更佳。鉴于LFA-1是一种整合素抗体，作者还在不同时间段观察了LFA-1的抗原在肿瘤血管内皮细胞上的表达量。结果表明，细胞间粘附因子1（ICAM-1）是其中唯一表现出昼夜节律的分子。此后，作者在“时间节律基因”敲除小鼠（Cdh^5creERT2:Bmal1^flox, Bmal1^DEC）体内观察到ICAM-1不再随时间变化而变化，并且淋巴细胞浸润也不再出现时间节律。

在免疫表型方面，作者比较了不同时间节点收获的肿瘤中，高表达抗肿瘤基因的淋巴细胞与高表达促肿瘤基因的淋巴细胞，非耗竭CD8+细胞与耗竭CD8+细胞等比值指标，发现这些免疫表型也受到时间节律的影响。在发现T细胞激活等基因表达也与时间节律相关后，作者聚焦于PD-1受体的表达量，通过RNA层面和表面蛋白两个层面确认了PD-1受体在肿瘤内CD8+T细胞上的表达受时间节律调节的现象。为了确认肿瘤内CD8+T细胞的PD-1表达与时间节律相关，研究团队还在体内实验中使用了“时间节律基因”敲除小鼠（Cd4^cre:Bmal1^flox, Bmal1^DT）进行研究，结果表明PD1受体在肿瘤内CD8+T细胞上的表达变化在“时间节律基因”敲除小鼠体内消失。

为了探究时间节律是否影响PD-1抗体治疗的效果，作者构建了黑色素瘤小鼠，并发现ZT1时间段注射PD-1抗体的效果不如ZT13时间段给药，且这一注射时间的不同，持续影响其后十数日的抗肿瘤效果。进一步的实验表明，注射PD-1抗体后，在ZT13时间段分离出来的肿瘤内CD8+T细胞在分泌能力和因子表达上稍强。最后，作者收集了不同时间段切除的黑色素瘤样本，通过分析样本的转录组数据，作者发现时间节律对淋巴细胞的影响同样在人身上存在。其中，作者着重提及了尽管CD8+T细胞在人黑色素瘤的浸润顶峰是下午早段，但这一时间的肿瘤内CD8+T细胞的耗竭程度也会更高。

概括而言，本文介绍了时间节律对免疫细胞尤其是CD8+T细胞，在肿瘤治疗方面的影响。研究团队在小鼠身上发现CD8+T细胞在晚上（ZT13）的肿瘤浸润程度更高，且在晚上对荷瘤小鼠进行免疫细胞疗法或抗体疗法都能获得更好的治疗效果。相应地，时间节律对人的黑色素瘤瘤内淋巴细胞的数量及生物特征也有影响，该研究或许可以帮助免疫细胞疗法更好地发挥抗肿瘤作用。

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