近年来，CAR-T疗法的成功让人们看到免疫治疗的巨大潜力，也成为人类攻克癌症历史上的重要里程碑。但目前CAR-T疗法主要仅针对血液肿瘤且容易引发细胞因子风暴，这也促使科研人员开发更有效的细胞疗法，CAR-NK的问世就被视为免疫治疗的新一代利器。

所谓CAR-NK细胞治疗，是通过基因工程技术将CAR表达于NK细胞表面，赋予和增强NK细胞对肿瘤的靶向杀伤功能。NK细胞属于固有淋巴细胞家族，存在于人外周血、骨髓和组织器官中，可以通过T细胞受体（TCR）和相关CD3分子的缺失，以及神经细胞黏附分子（也称为CD56）的表达所鉴定。值得庆幸地是，异体来源NK细胞不表达个体特异性TCR，不同于T细胞通过TCR特异性识别MHC—抗原肽复合物产生活化信号进而激活的方式，NK细胞发挥杀伤靶细胞的作用无须抗原刺激、抗原提呈且无自体MHC限制性，在临床治疗中出现移植物抗宿主病的风险远低于异体T细胞治疗。另外，基于NK细胞的“自我缺失”识别模式，无论是单独输注还是联合造血干细胞移植，与受者KIR基因不相合的供者NK细胞抗肿瘤作用更强，更适宜被开发为通用型免疫细胞治疗产品，有利于大规模产业化应用。

随着基因修饰技术的进步，许多方法被用于生产CAR-NK。CAR-NK细胞疗法的主要挑战之一是基因转移效率低。与其他基因转移方法相比，逆转录病毒转导用途广泛，高效且无明显毒性。具体优势体现在以下几个方面：
一、逆转录病毒具有相对中性的整合谱，遗传毒性较小

临床应用最常用的逆转录病毒载体包括源自人类免疫缺陷病毒-1（慢病毒载体）和莫洛尼鼠白血病病毒（γ逆转录病毒载体）的载体。整合组分析表明，γ逆转录病毒载体优先整合在转录起始位点、CpG岛和对癌症有影响的基因附近，而慢病毒载体倾向于整合在主动转录的基因中^[1]。相比之下，α逆转录病毒载体具有相对中性的整合谱，更有利于应用到临床研究中^[2]。然而，以前的研究使用携带病毒编码序列和完整长末端重复序列（LTR）的α逆转录病毒载体。虽然病毒编码序列在宿主细胞中具有潜在的免疫原性并增加载体动员的风险，但含有转录元件的完整LTR能够激活细胞基因并有助于插入诱变^[1]。

目前，已开发了γ和α逆转录病毒自失活（SIN）载体，从LTR中去除了增强子和启动子元件，并建立了一个先进的分裂包装系统，另外从载体中去除病毒编码序列和逆转录病毒剪接位点，以解决插入式诱变的问题^[6]。此外，通过多种策略，包括删除自我复制所需的基因以及减少病毒基因组和载体生成细胞的重叠序列，已经降低了形成复制能力逆转录病毒（RCR）的可能性，这些策略已用于许多临床研究^[3、4]。
二、逆转录病毒转导NK细胞效率高

几十年来，逆转录病毒一直被用作基因治疗载体。NK细胞对逆转录病毒转导的抵抗力的可能解释可能源于细胞对病毒感染的固有防御机制。提高逆转录病毒转导效率的策略包括用细胞因子（IL-2）和K562细胞预活NK细胞，以表达膜结合的IL-21。逆转录病毒载体转染NK细胞效率为27％-52％，编码分泌型IL-15或膜结合型IL-15（mIL-15）基因的逆转录病毒的转导效率可达70％^[3]。

不同种类的逆转录病毒被用来制备CAR-NK细胞。与γ逆转录病毒和慢病毒相比，RD114α逆转录病毒在原代NK细胞的转导效率上更高。在不同逆转录病毒中，α-逆转录病毒载体显示出比γ-逆转录病毒载体更优越的性能，在NK细胞系中的转导效率为90%，在受刺激的原代NK细胞中的转导效率大于60%。

截止到2021年底，已经有20项使用CAR-NK细胞系的研究和15项使用原代NK细胞的研究应用了逆转录病毒。另外，最近的一项I期临床试验中，由逆转录病毒转导的CD19 CAR-NK细胞治疗CD19+非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。在这项研究中，73%的患者有响应，8名患者中有7名获得完全缓解。此外，在所有剂量水平下，CAR-NK输注后30天内反应迅速。经过一年的随访，仍然可以检测到扩增的CAR-NK细胞。输注后，外周血中的CAR-NK DNA拷贝数保持稳定达一年之久，这些结果首次表明逆转录病毒转导的CAR-NK细胞可以在体内长期存活^[5]。
三、逆转录病毒可以通过稳定的包装细胞系达到一致、经济、大规模的载体生产

随着越来越多的临床试验使用γ逆转录和慢病毒载体进行稳定基因组修饰的基因治疗，对临床适用的逆转录病毒载体批次的需求不断增加，这表明经济载体生产对未来基因治疗试验的重要性。与瞬时转染相比，使用稳定的包装细胞系有望实现一致、经济、大规模的载体生产，从而有可能治疗更多的患者。

逆转录病毒独特的复制能力允许转基因稳定地整合到目标基因组并长期表达CAR，但只能在分裂的NK细胞中表达。一般来说，逆转录病毒载体可以通过瞬时转染或稳定的包装细胞系产生。这两种方法在建立、灵活性、可重复性、扩大可能性和质量保证方面具有明显的优缺点。对于瞬时生产，将包装系统的所有组件以质粒的形式瞬时递送到包装细胞中。这允许灵活地改变载体成分。相比之下，建立稳定的包装细胞系需要将所有组件稳定地整合到产生病毒的包装细胞系的基因组中，虽然前期工作需要较为耗时，且需要进行技术平台的搭建及活化。但是通过稳定的包装细胞系生成病毒载体可以高水平在保证批次间产品一致性，而瞬时产生的病毒颗粒则受到显着波动的影响。由于要达到生产规范（GMP）级质粒，瞬时转染生产过程的升级成本高昂且技术要求很高。所以，从监管、生产相关以及经济角度来看，通过稳定的包装细胞系生成病毒载体是首选^[4]。
四、逆转录病毒可以通过假分型增强对NK细胞的基因转移效率
逆转录病毒假分型是指在病毒载体上掺入来自其他包膜病毒的糖蛋白，允许逆转录病毒载体转导更广泛的细胞和组织。增强 NK 细胞转导的一种方法是选择最佳假型包膜蛋白。目前。已有研究结果提出了使用RD114-TR假型逆转录病毒颗粒与Vectofusin-1结合使用作为对PBMC来源的NK细胞进行基因修饰以高产量获得高细胞毒性CD19-CAR-NK细胞的成功策略，并且α逆转录病毒转导的CAR-NK细胞比慢病毒转导的CAR-NK细胞具有更高的细胞毒性^[6]。有研究认为在α和γ逆转录病毒环境中，RD114 / TR假型病毒颗粒的基因转移水平高于VSVg假型病毒颗粒。这种转导效果可能部分是由于中性氨基酸转运蛋白2（ASCT-2，SLC1A5）的表达，RD114/TR利用该转运蛋白进入细胞。使用RD114 / TR假型α逆转录病毒颗粒与Retronectin介导的转导相结合，可在NKL细胞系中稳定转导水平超过90%，在原代NK细胞中稳定转导水平高达60%^[2]。

参考文献

[1] Suerth, Julia D et al. “Alpharetroviral vectors: from a cancer-causing agent to a useful tool for human gene therapy.” Viruses vol. 6,12 4811-38. 5 Dec. 2014, doi:10.3390/v6124811

[2]Suerth, J.D., Morgan, M.A., Kloess, S. et al. Efficient generation of gene-modified human natural killer cells via alpharetroviral vectors. J Mol Med 94, 83–93 (2016).

[3]Matosevic, Sandro. “Viral and Nonviral Engineering of Natural Killer Cells as Emerging Adoptive Cancer Immunotherapies.” Journal of immunology research vol. 2018 4054815. 17 Sep. 2018, doi:10.1155/2018/4054815

[4]Matosevic, Sandro. “Viral and Nonviral Engineering of Natural Killer Cells as Emerging Adoptive Cancer Immunotherapies.” Journal of immunology research vol. 2018 4054815. 17 Sep. 2018, doi:10.1155/2018/4054815

[5]Franks SE, Wolfson B, Hodge JW. Natural Born Killers: NK Cells in Cancer Therapy. Cancers (Basel). 2020 Jul 31;12(8):2131. doi: 10.3390/cancers12082131.

[6]Müller, Stephan et al. “High Cytotoxic Efficiency of Lentivirally and Alpharetrovirally Engineered CD19-Specific Chimeric Antigen Receptor Natural Killer Cells Against Acute Lymphoblastic Leukemia.” Frontiers in immunology vol. 10 3123. 24 Jan. 2020, doi:10.3389/fimmu.2019.03123

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