CRISPR/CAS9技术在细胞治疗领域应用
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）最初发现于20世纪80年代末，是一种由交替重复和非重复DNA序列组成的不寻常的遗传结构。CRISPR/Cas系统本质上是一种针对外源DNA的细菌防御机制。基因组分析表明，CRISPR和Cas蛋白作为获得性免疫系统发挥作用，并通过RNA引导的DNA切割系统保护原核DNA免受噬菌体和质粒DNA的攻击[1, 2]。
CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是目前研究最深入、技术最成熟、应用最广泛的一种类别。CRISPR/Cas9系统由一个单链向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）和一个具有核酸内切酶功能的Cas9 蛋白组成。在sgRNA特异性识别下，Cas9蛋白到达基因组特定位点，对双链DNA（double-stranded, dsDNA）进行切割，产生dsDNA断裂（double-strand break, DSB）。然后，DSB通过细胞自主性的非同源末端连接（nonhomologous DNA end joining, NHEJ）或同源重组（homology-directed repair, HDR）进行修复，其中占主导地位的NHEJ修复容易引发突变[3]。
二、CRISPR/Cas9系统递送技术
天然的Cas蛋白在编辑效率和特异性等方面仍存在许多局限性，可能会在错位的基因位点切割DNA双链，从而导致潜在风险，显著影响了它的实际应用。研究者们通过开发不同的Cas9变体，来降低错配率，增加编辑效率[4-6]。
CRISPR/Cas9系统的递送方式也是影响基因编辑效率关键因素之一[7]。递送主要通过三种形式：①递送编码Cas9和sgRNA的质粒DNA；②递送Cas9 mRNA和sgRNA元件；③递送RNP(ribonucleoprotein,Cas9蛋白和sgRNA复合物）。根据不同的递送形式选择不同的递送方式，可以根据细胞进入机制分成主要的三组：（1）生物方法，（2）化学方法，（3）物理方法。生物方法利用天然生物材料，例如病毒蛋白，多肽或者细胞受体/膜来介导进入细胞。这一类别包括病毒载体，病毒样粒子（VLPs），以及细胞穿透肽（CPPs）。化学方法使用人工合成的材料，例如聚合物，脂质，或者金属，来促进进入细胞。这类包括脂质体，金纳米粒子（AuNPs），以及脂质纳米粒子（LNPs）。物理方法依赖于电力或者超声的物理能将基因递送进细胞。这一类别包括电穿孔，声孔效应，以及显微注射。
图2 CRISPR/Cas9递送系统（图片来自J Control Release, 2022, 342: 345-61）
三、CRISPR/Cas9技术在基因与细胞治疗研究进展
CRISPR/Cas9技术相比一代和二代基因编辑技术，因其操作便捷、简单、高效等特点，在基因敲除、基因沉默、基因敲入、基因激活及表观遗传修饰等方面表现出色，被广泛应用于生物医药医学研究。Transparency Market Research (TMR)发布的一份题为《CRISPR和Cas基因市场-全球行业分析、规模、份额、增长、趋势和预测，2018-2026》的报告称，到2026年，全球CRISPR和Cas基因市场价值达到72.345亿美元，2018年至2026年的复合年增长率约为20.1%。基因编辑技术用于预防多种疾病，以及慢性病替代医学的需求增加以及亚太地区主要参与者的投资增加，预计将是2018年至2026年推动市场发展的主要因素。
（1）CRISPR/Cas9 全基因组功能筛选
通过构建CRISPR-Cas9文库，可大规模筛选、分析、验证一些药物靶点、抗药基因，为疾病治疗提供相关数据。研究人员利用CRISPR-Cas9文库全基因组筛选人类胃癌AGS细胞潜在治疗靶点，最终41个必需基因被确定为潜在的药物靶标[8]。此外，利用CRISPR-Cas9文库对癌症细胞中关键的转录因子p53和ERα的增强子元件的685个基因位点进行筛查，共鉴定出3个增强元件与ERα的相关；3个增强元件与p53功能相关联，其中2个增强元件与p53完全结合才能激活细胞衰老过程[9]。
（2）模型构建
疾病模型主要用于模拟人类疾病的生物学和病理特征的研究，在疾病发生机制和药物筛选等方面中发挥关键作用。
大多数动物模型都是通过敲除特定基因构建的[10]。研究人员利用CRISPR技术靶向猴子SHANK21基因的外显子3，成功构建了由于SHANK3基因突变而导致猴子及其F1后代的ASD模型，显示出非典型的自闭症表型，如重复行为增加以及社交和学习缺陷等[11]。基于单碱基编辑的点突变敲入在构建动物模型具有较大潜力。研究人员通过对RAG1、RAG2和IL2RG位点终止密码子进行单碱基编辑，提前结束基因的表达。将这些胚胎种植给代孕猪后，发现携带纯合或杂合突变的仔猪都会因胸腺和脾严重发育不足，造成免疫缺陷导致肺部感染等。这也是第一次将单碱基编辑技术用于大型动物[12]。除此之外，构建体外细胞模型也有助于筛选药物作用靶点，为揭示药物作用机制以及疾病机制提供依据。
（3）细胞治疗
免疫治疗是通过调动患者自身免疫系统杀伤肿瘤细胞的一种方法，主要分为免疫检查点阻断和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）。CRISPR/Cas9技术不同于转基因技术的随机整合，可以精准靶向目的基因，进行基因改造。由于异体CAR-T细胞存在内源性HLA和TCR，阻碍治疗的广泛应用，人们提出了多种治疗策略去制备CAR-T。考虑到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）在诱发细胞因子风暴中的重要作用。2019年，Sterner等[13]使用CRISPR/Cas9对CD19 CAR-T细胞的GM-CSF基因进行敲除。该项研究结果表明，GM-CSF基因敲除的CAR-T细胞的GM-CSF的分泌的确明显减弱，但是对CAR-T细胞的重要功能并未造成影响，更重要的是GM-CSF缺陷的CD19 CAR-T细胞比野生型的CD19 CAR-T细胞在体内具有明显的抗肿瘤效果。2020年Carl June等[14]去除内源性T细胞受体（TCR）和免疫检查点分子程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）改善工程T细胞的功能和持久性，引入了合成的癌症特异性TCR转基因（NY-ESO-1）来识别肿瘤细胞（第一个多重CRISPR/Cas9编辑工程应用于临床试验）。同年我国卢铀教授CRISPR-Cas9编辑PD-1 T细胞在晚期非小细胞肺癌患者中的首次人体I期临床试验的结果（ClinicalTrials.gov NCT02793856），其余临床试验如下表所示[15]。
表1 正在进行的使用CRISPR技术设计的免疫疗法治疗人类癌症临床试验
（4）基因治疗
基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。CRISPR/Cas9技术凭借其编辑效率高、可同时靶向多个靶基因等特点，已被用于肿瘤、神经退行性疾病、造血系统疾病和艾滋病等疾病的基因治疗。
CRISPR Therapeutics宣布了其名为CTX001的疗法取得了早期成功，该疗法通过电穿孔将CRISPR-Cas9递送至造血干细胞。用白消安对患者自身的造血干细胞进行化学清除后，将被CRISPR-Cas9编辑后的造血干细胞输注回患者体内。接受治疗的β-地中海贫血或镰状细胞病患者长时间不再依靠输血治疗[16]。
NTLA-2001正在开发作为转甲状腺素蛋白(ATTR)淀粉样变性病的单剂量治疗制剂。NTLA-2001是一种体内基因编辑治疗剂旨在通过降低血清中TTR的浓度来治疗ATTR淀粉样变。该疗法基于CRISPR/Cas，它是第一个，以脂质纳米颗粒的形式被输送到血液中全身给药的CRISPR疗法[17]。
Editas Medicine公司研发的一款仍处于临床试验期的产品EDIT-101。该药物使用AAV介导递送CRISPR/Cas9，通过sgRNA靶向以去除由CEP26基因中的IVS290突变产生的异常剪接供体，并恢复正常的CEP290表达治疗先天性黑蒙。该疗法可以做到一次性给药即治愈（NCT03872479）。
参考文献
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