嵌合病毒载体
腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)无论在体内和体外试验中均被广泛应用于基因转导实验。AAV可以感染大量种类的哺乳动物细胞,在人体内只产生极低的免疫原性,这些特点使重组AAV成为当今应用于基因治疗的高效病毒载体。在基因治疗的临床前和临床阶段的研究中,可通过Baculovirus-AAV嵌合病毒载体高效且大规模生产重组AAV以符合剂量和安全性要求。
利用杆状病毒(Baculovirus)生产重组AAV需要将两种杆状病毒共转导昆虫Sf9细胞。第一种杆状病毒表达位于两个AAV ITR元件之间的目的基因,第二个杆状病毒表达AAV rep和cap基因。为制备两种杆状病毒,每种杆状病毒的表达框均被克隆至一个杆状病毒转移质粒。该质粒的整个表达框与庆大霉素(Gentamycin)抗性基因位于质粒上的两个Tn7转座子末端序列之间(Tn7L和Tn7R)。该质粒被转化至带有杆粒(Bacmid)和辅助载体的大肠杆菌。杆粒可以被看作一个特别巨大的质粒,包含了修饰过后的杆状病毒基因组序列。该序列上带有lacZ基因以及位于该基因内部的attTn7位点。因此转移质粒上两个Tn7之间的序列通过Tn7转座酶与杆粒重组后将插入lacZ基因,随后通过庆大霉素抗性筛选和蓝白筛选即可获得重组成功的大肠杆菌。从大肠杆菌提取的杆粒纯化后用于转染昆虫Sf9细胞。
使用AAV转导宿主细胞时,两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一同进入细胞,线性双链DNA基因组以游离体DNA的形式存在于细胞核中。在分裂细胞中,由于游离体DNA不跟随细胞复制,AAV基因组将随着细胞分裂逐渐丢失,因此在整体细胞中被稀释。重组AAV的DNA随机整合宿主基因组的现象是非常罕见的,这对于需要考虑外源DNA插入宿主基因组引发致癌风险的基因治疗来说是相当适用的特点。
AAV的另一个应用优点在于,在大多数情况下,可以在生物安全1级(BSL1)设施中完成操作。重组AAV是复制缺陷型的,不会引起炎症反应和引发人类疾病。
人们已从自然界中鉴定出许多AAV病毒株,根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织嗜性(即感染组织特异性)。