王建勋教授团队自2020年开始进行基于噬菌体展示技术的纳米抗体筛选平台的建设，目前已完成对抗SARS-CoV-2免疫文库的构建及抗体筛选，团队进一步的研究目标还包括筛选新型的单链可变抗体（single-chain variable fragment，ScFv）及纳米抗体作为CAR的靶向结构域。

基于噬菌体展示的方法、纳米抗体的优良生物特性及RBD与ACE2结合介导病毒进入宿主细胞的基本原理，本研究利用实验室前期构建的抗SARS-CoV-2噬菌体纳米抗体免疫文库，以野生型SARS-CoV-2 RBD（记为SARS-CoV-2 RBD WT）为靶标抗原，采用RBD-ACE2竞争淘选方法对文库进行淘筛，成功得到了一种能够在体外高效阻断SARS-CoV-2 RBD与ACE2重组蛋白结合的纳米抗体，且该抗体显示出了对SARS-CoV-2 WT假病毒的高效中和能力，经结构分析表明该抗体能特异性结合RBD与ACE2的共享表位。此外，本研究还通过测定该纳米抗体与展示SARS-CoV-2突变株RBD的重组噬菌体的结合，初步推断了该纳米抗体对新冠病毒几个关键突变株的结合能力。 

论文简介
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新冠肺炎在全球的传播突显了快速开发针对SARS-CoV-2的治疗和预防药物的高效方法的必要性。在众多疗法中，相较于传统疫苗研发、小分子药物开发耗时长，血浆疗法来源有限成效不定且难以推广，中和抗体的优势逐渐突显。中和抗体是经过人为筛选、制备验证后得来的针对新冠病毒具有预防治疗双重作用的抗体，成分单一、安全性好，可精准靶向新冠病毒的抗原位点。在对主要感染部位是呼吸道和肺部的病毒性肺炎的治疗策略中，纳米抗体（nanobody，Nb又称为重链可变区单域抗体，variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH）的使用具有其独特优势。得益于纳米抗体分子量小、常温下能保持稳定等优良的理化性质，有效雾化并局部给药以提高呼吸道、肺泡等病毒感染病灶部位的药物浓度成为可能。

噬菌体库普通淘选的一般流程是表面展示纳米抗体的噬菌体与固定化目标抗原SARS-CoV-2 RBD识别并结合，经过足够时间的孵育之后，通过严格的洗涤条件洗去与抗原结合较弱或者未结合的游离噬菌体，随后将特异性结合的目标噬菌体洗脱下来，感染大肠杆菌并进行扩增以得到下一轮的子噬菌体库。经过3～5轮的“吸附-洗脱-扩增”富集过程后，能够与抗原特异性结合的噬菌体的比例得到了逐步提高，最终获得能够识别靶分子的纳米抗体用于后续的实验。本研究设计的简便快捷的噬菌体免疫文库竞争筛选模式（图1），在第二、三轮淘选的阶段动态地引入了非固定化的ACE2蛋白与展示VHH噬菌体竞争与固定化靶抗原SARS-CoV-2 RBD的结合，从而在淘选流程中集合了亲和力筛选和竞争淘选的双重目标（表1）。

图1. 噬菌体纳米抗体库RBD-ACE2竞争淘选流程示意图

表1.淘选流程条件及每轮的富集度计算结果

D. RBD-ACE2-phage竞争ELISA结果显示，4种展示VHH噬菌体能够与ACE2相互竞争以结合SARS-CoV-2 RBD，其中A5克隆的竞争结合能力最强。

通过同源重组构建“pET-VHH5-05-His”质粒转入BL21（DE3）表达菌株。在30℃，220rpm培养条件下用IPTG诱导目的蛋白的生产，生产6h后，将细胞破碎上清中的可溶性蛋白进行Ni柱亲和纯化，并对纯化过程的流穿液、清洗液、洗脱样品进行SDS-PAGE分析，结果显示洗脱得到的目的蛋白纯度高，分子量大小在13KD左右，与理论分子量符合。

A. 蛋白表达SDS-PAGE鉴定。M：标准蛋白Marker；1：诱导后全菌；2：超声破碎后上清；3：超声后破碎沉淀.
B.蛋白纯化SDS-PAGE分析。M：标准蛋白Marker；1：破碎后上清；2：流穿；3-14：梯度咪唑洗脱。

为了评价纯化后的VHH5-05抗体的生物活性，团队通过ELISA验证了该抗体的结合特异性及测定抗体亲和力，结果表明VHH5-05能够以高亲和力（EC50=0.03 nM）特异地结合SARS-CoV-2(WT)RBD。同样以竞争ELISA实验验证纯化抗体在体外阻断RBD与ACE2重组蛋白结合的能力，在浓度为0.5µg/mL时，VHH5-05显示出明显的RBD-ACE2结合阻断作用，且在浓度降低至0.1µg/mL的情况下其阻断效果仍然显著，进一步证实了本研究设计采用的竞争淘选方法的可行性。基于该验证步骤的结果，可以初步推断筛选出的VHH5-05抗体与RBD-ACE2的结合位点有相当重合。进行假病毒中和试验以测定VHH5-05的中和活性，结果表明，VHH5-05能高效中和SARS-CoV-2WT假病毒，其IC50为0.026μg/mL。

制备含有SARS-CoV-2各突变株RBD片段的重组改造M13KO7噬菌体，使用高吸附酶标板包被纯化得到的纳米抗体，分别加入各突变株RBD重组噬菌体以结合抗体，采用qPCR法扩增结合在板上的噬菌体的基因片段以间接地反映纳米抗体与重组噬菌体的特异性结合情况，用于初步验证纳米抗体与SARS-CoV-2不同突变株 RBD的结合活性。结果发现本研究筛选纯化得到的纳米抗体VHH5-05，不仅只对展示野生型RBD的噬菌体表现出了强的结合能力，对展示Beta突变株RBD和Delta突变株RBD的噬菌体也表现出明显的结合。然而，本次筛选出的纳米抗体未能对展示Omicron突变株 RBD的噬菌体表现出结合能力，这与众多研究得出的Omicron突变株逃逸了绝大部分现有中和抗体的结论一致。

A. VHH5-05与SARS-CoV-2 RBD的结合特异性；B. VHH5-05与SARS-CoV-2 RBD的结合亲和力测定；
C. RBD-ACE2-VHH5-05竞争ELISA结果显示VHH5-05能在体外高效阻断RBD-ACE2重组蛋白的结合；

D. VHH5-05假病毒中和能力测定；E. VHH5-05与展示新冠病毒突变株RBD重组噬菌体结合的分析。

为了探索VHH5-05阻断SARS-CoV-2 RBD和ACE2之间相互作用的结构基础，模拟了VHH5-05和RBD复合物的结构，并与RBD-hACE2复合物进行了结合表位的比较。VHH5-05的同源模型通过SWISS-model在线服务器建立，以MOE软件进行分子对接以模拟蛋白质相互作用，Dock包中的蛋白质-蛋白质对接模块用于实现RBD和VHH5-05之间的对接计算。SARS-CoV-2的受体结合基序（receptor‑binding motif ，RBM）为437-508 aa。hACE2中与RBM相互作用的关键氨基酸为K31、E35、D38、M82和K353。与SARS-CoV-2相对应的氨基酸为L455、F486、Q493、S494、N501和Y505。建模分析结果表明，RBD-VHH5-05表位上的大多数残基与RBD-ACE2结合界面重叠，特别是SARS-CoV-2 RBD的关键位点F486、Q493和S494参与了其与VHH5-05的结合，这也再次支持了该纳米抗体能够有效阻断RBD-ACE2结合的研究结论。

A. hACE2与SARS-CoV-2RBD复合物的晶体结构，RBD和ACE2分别为蓝色和粉色；B. 纳米抗体VHH5-05（青色）与RBD的模拟结合结构分析。 
 

总结
常规的噬菌体筛选是先拿到结合目标靶抗原的抗体，表达纯化后验证是否具有生物学功能，再验证是否能阻断受体与配体的结合，通常在高通量筛选中的几百甚至几千个抗体中才有机会得到三两个到十几个具有阻断活性的抗体，效率低且成功率不高。本研究以一种组合筛选策略:严格的淘选和引入非固定化ACE2进行竞争，指导淘选过程，整个流程以低成本且方便快捷的方式，增加了筛选出高亲和力且能直接阻断RBD与ACE2结合的抗体展示噬菌体的可能性，将是体外淘筛能直接阻断SARS-CoV-2 RBD-ACE2结合的纳米抗体的最佳选择之一。

尽管最有效的中和抗体往往直接干扰RBD和ACE2的结合，这也是本研究开发竞争淘选方法的初衷，然而在Omicron变异株中发现的大多数RBD突变（15个中的9个）位于ACE2与RBD的结合基序RBM中， 高度可变的Q493/N/E/R/Y可能是导致纳米抗体VHH5-05被Omicron逃逸的直接原因。可喜的是，已有相关研究表明开发针对S蛋白或RBD隐藏位点、保守中和位点、非ACE2竞争位点等筛选得到的中和抗体仍具备一定的抵抗Omicron突变株感染的能力。我们期待，多方法多平台的应用和抗体药物等的发现能为人类构建机体“免疫长城”添砖加瓦，为细胞免疫治疗各类疾病贡献力量。